網羅的タンパク質相互作用解析

網羅的タンパク質相互作用解析
Analysis of genome-wide protein-protein interactions using cell-free based protein array

（担当：澤崎 達也）
(Member in charge: Tatsuya Sawasaki)

【概要】
Introduction

生体内の多くのタンパク質は、他のタンパク質と複合体を形成し機能を発揮する。そのため、相互作用するタンパク質を同定することは、標的タンパク質の理解を進めるうえで重要な情報となる。

また近年、転写因子や足場タンパク質など酵素活性を有しないタンパク質を標的とした創薬の重要性が指摘されている。そのため、生体内で機能を発揮するために必要な相互作用タンパク質を同定し、その相互作用を抑制する薬剤の開発が積極的に進められている。つまり、相互作用タンパク質を新たに見出すことは、標的タンパク質の理解だけでなく、薬剤開発に繋げることが可能となる。

本支援では、コムギ無細胞タンパク質合成系を基盤に構築した2万8千種からヒトプロテインアレイを対象にした相互作用タンパク質探索、もしくは、転写因子、プロテインキナーゼなど機能やファミリーごとに分類したフォーカスドアレイを用いて、被支援者が研究対象とするタンパク質と相互作用するタンパク質を同定・解析、さらに相互作用阻害剤の探索等を行う。

Many proteins in living organisms form complexes with other proteins to perform their functions. Therefore, identification of interacting proteins is important information for understanding target proteins.

In recent years, the importance of drug discovery targeting proteins that do not have enzymatic activity, such as transcription factors and scaffold proteins, has been pointed out. For this reason, the identification of interacting proteins that are necessary for their function in vivo and the development of drugs that inhibit their interactions are being aggressively pursued. In other words, finding new interacting proteins can lead to not only understanding of target proteins but also drug development.

In this support, we will perform the screening of interacting proteins on human protein arrays consisting of about 28,000 recombinants constructed on the basis of wheat cell-free protein synthesis system, or identify and analyze proteins that interact with proteins to be studied by the grantee using the focused arrays classified by function or family, such as transcription factors and protein kinases, and also look for interaction inhibitors.

【材料・方法】
Materials and Methods

まず、こちらから送付する指定ベクターに研究対象とする標的遺伝子を組み込んだプラスミドをこちら送って頂く。タンパク質-タンパク質間相互作用には、AlphaScreenシステムを利用する。ヒトプロテインアレイは、FLAG-GSTがN末側に付与されている。そのため、上記プラスミドに組み込むことで、N末端もしくはC末端にビオチンを付与した標的タンパク質をコムギ無細胞タンパク質系で合成することができる。

384穴のプレートのウェル内の反応系に、プロテインアレイとビオチン化標的タンパク質を1µLずつ混合後、抗FLAG抗体と2種類のAlphaScreen用ビーズを添加する。1時間のインキュベーション後、384穴プレートをAlphaScreen専用プレートリーダで化学発光値を計測することで、相互作用を検出することができる。検体数が数百種類を超える場合は、我々が保有の自動分注器を用いて行う。

First, we ask you to send us a plasmid incorporating the target gene to be tested in a designated vector that we will send to you. For protein-protein interactions, we use the AlphaScreen system. The human protein array has FLAG-GST on the N-terminal side. Therefore, by incorporating them into the above plasmid, target proteins with biotin at the N- or C-terminus can be synthesized in the wheat cell-free protein system.

After mixing 1µL of protein array and biotinylated target protein in the reaction system in the wells of a 384-well plate, add anti-FLAG antibody and two types of AlphaScreen beads After 1 hour of incubation, the 384-well plate is incubated with a dedicated AlphaScreen plate reader The interaction can be detected by measuring chemiluminescence values. If the number of samples exceeds several hundred, we use our automated pipetting system.

【応募条件】
Requirement of the support

1. 被検タンパク質の合成もこちらで支援します。
2. タンパク質-タンパク質以外、例えばタンパク質-核酸もしくは脂質など多様な相互作用解析も可能ですので、必要に応じて相談して下さい。

1. We can also prepare the bait recombinant protein(s) for the screening.
2. We can also perform a variety of interaction analyses other than protein-protein, such as protein-nucleic acid or lipid, etc. Please consult with us if necessary.

【参考文献】
References

1. Yamanaka S, Murai H, Saito D, Abe G, Tokunaga E, Iwasaki T, Takahashi H, Takeda H, Suzuki T, Shibata N, Tamura K, Sawasaki T. Thalidomide and its metabolite 5-hydroxythalidomide induce teratogenicity via the cereblon neosubstrate PLZF. EMBO J. 2021 Feb 15;40(4):e105375. doi: 10.15252/embj.2020105375.
2. Morishita R, Sugiyama S, Denda M, Tokunaga S, Kido K, Shioya R, Ozawa S, Sawasaki T. CF-PA2Vtech: a cell-free human protein array technology for antibody validation against human proteins. Sci Rep. 2019 Dec 18;9(1):19349. doi: 10.1038/s41598-019-55785-5.
3. Nemoto K, Ramadan A, Arimura GI, Imai K, Tomii K, Shinozaki K, Sawasaki T. Tyrosine phosphorylation of the GARU E3 ubiquitin ligase promotes gibberellin signalling by preventing GID1 degradation. Nat Commun. 2017 Oct 17;8(1):1004. doi: 10.1038/s41467-017-01005-5.