機能ゲノミクス探索
Functional genomics support by shRNA screening
（担当：松本 健）
（Member in charge: Ken Matsumoto）
バーコードshRNAシークエンス技術による分子探索支援
Molecular Analysis Support by Barcode shRNA Sequence Technology
抗がん活性などをもつ化合物がどのような作用機序で細胞増殖を抑制するのかを明らかにすることは、その化合物の性状解析や創薬研究にとって非常に重要である。化合物の標的分子の同定法には、本支援活動の化合物評価で行う分子プロファイリングや化合物を修飾して相互作用する分子を検出する方法のほか、酵母などのモデル生物を用いた遺伝学的方法などがあるが、どの方法が適しているかは化合物ごとに異なり、複数の方法を利用することはメリットが大きい。そのうち遺伝学的方法は、直接の標的分子、作用機序に関わる遺伝子経路、あるいは合成致死に関わる遺伝子経路の同定につながる可能性が期待される。特に疾患をもたらす遺伝子変異に対する合成致死遺伝子の同定は、化合物の作用機序解明に重要な情報を与えるだけでなく、がんなどの治療標的となるために注目されている。そこで本支援では、化合物の作用機序解明、および細胞の表現型の原因遺伝子解明の一助として、哺乳類培養細胞でのウイルスベクターベースのプール型バーコード付きshRNA（short hairpin RNA）ライブラリーによる標的遺伝子経路のスクリーニング解析および技術支援を行う。
Elucidation of the mode of action of bioactive compounds is still a challenge. Genome-wide RNAi technology in mammalian cultured cells provides an opportunity to identify genes that are functionally relevant to the mode of action of a compound in an unbiased and comprehensive manner. We support researchers to elucidate the mode of action of compounds of their interest by serving a barcoded-shRNA library screen. This approach will also be useful in identifying synthetic lethal genes working in a particular genetic background.
【方法】
Methods
まず、ヒト培養細胞にサンプル化合物を添加し、増殖抑制に必要な濃度を決定する。次に、用いる培養細胞にshRNAライブラリーを形質導入し、個々の遺伝子をノックダウンした細胞集団を作成する。これを２つに分け、一方を化合物処理、他方を無処理の対照として一週間から二週間ほど培養を続けて細胞を回収する。また、変異株細胞の解析の場合には、親株と変異株にshRNAライブラリーを形質導入し、導入早期の細胞と、二週間ほど培養を続けた後の細胞を回収する。これら各細胞集団のゲノムDNAからshRNA遺伝子領域をPCR増幅して次世代シークエンスのためのライブラリーとする。
Human cultured cells transduced with a lentiviral barcoded shRNA library are treated with a low concentration of a compound of interest for a week or more. Alternatively, mutant cells and wildtype cells transduced with an shRNA library are cultured for a week or two. Genomic DNA samples are isolated from the survived cells, and the shRNA-specific barcode sequences in the genome DNA samples are amplified by PCR. Amplified DNAs from the two populations are sequenced to measure the relative abundance of each barcode in the two populations.
【評価】
Analysis
得られたPCR産物の次世代シークエンスによって解析し、各shRNA遺伝子に付随した固有のバーコード配列のリード数から、ノックダウンによってサンプル化合物への感受性あるいは変異株細胞の増殖に特異的に影響を与える遺伝子を同定する。
Based on the ratio of barcode read counts from the two cell populations, candidate genes that affect the growth sensitivity of cells to the compound or that affect the growth of mutant cells are determined.
【支援条件】
Conditions
shRNAライブラリーの使用許諾契約により、商用目的の解析は支援対象外とします。
Non-profit researches only.
【参考文献】
References
- 松本 健、高橋陵宇、山本佑樹、田原栄俊 (2021) 機能ゲノミクス探索、マウス・ラットモデル作製・解析プロフェッショナル（先端モデル動物支援プラットフォーム (AdAMS) 編）、276-292、羊土社 (in Japanese)
- Matsumoto, K., and Yoshida, M. (2022) Mammalian chemical genomics towards identifying targets and elucidating modes-of-action of bioactive compounds, ChemBioChem, 23, e202100561. doi: 10.1002/cbic.202100561. https://doi.org/10.1002/cbic.202100561
- Takase, S., Kurokawa, R., Kondoh, Y., Honda, K., Suzuki, T., Kawahara, T., Ikeda, H., Dohmae, N., Osada, H., Shin-ya, K., Kushiro, T, Yoshida, M., and Matsumoto, K. (2019) Mechanism of action of prethioviridamide, an anticancer ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide with a polythioamide structure. ACS Chem. Biol., 14, 1819-1828. https://doi.org/10.1021/acschembio.9b00410