プロテオーム解析による分子プロファイリング
Molecular Profiling by Proteomic Analysis
（担当：堂前 直、室井 誠）
(Members in charge: Naoshi Dohmae and Makoto Muroi)
【概要】
Summary
支援依頼者から提供された被検化合物を細胞に処理し、2D-DIGEを用いてプロテオームの変動を解析し、多変量解析を用いて作用点の明らかな化合物と比較することによって作用点を予測する。これまでの研究で、HeLa細胞に化合物を処理した場合、化合物の作用機作に応じてプロテオームの特徴的な変化があらわれることを明らかにしている。具体的には、化合物処理HeLa細胞について2次元電気泳動を用いたプロテオーム解析を行い、プロテオーム解析で得られたタンパク質スポットの定量値より多変量解析を用いて化合物間の類似度を算出し、当該化合物の作用を推定する。それに加え、化合物処理で特徴的に変化したタンパク質スポットの情報を基に、化合物の作用するパスウェイを推定・評価する。また、詳細な解析が必要なサンプルに関しては（年間１サンプル程度を予定）LC-MS/MSを用いて発現解析、あるいは、関連タンパク質の同定を行う。
ただし、HeLa細胞を用いるため、HeLa細胞に標的がない場合や、プロテオームの変化が十分に認めらない場合には評価が難しい。
In our previous research, we have shown that proteomic change occurs according to the target of the compounds. Cells are treated with compounds provided by the person to be supported and proteomic analysis of lysates of the cells is performed by 2D-DIGE. Comparing the proteomic changes with that of standard compounds in our database, the target of the compounds will be estimated. Practically, the lysates of HeLa cells treated with the compound are analyzed by two-dimensional electrophoresis-based proteomic analysis. Then, using quantitative data, the similarity between the compounds and standard compounds in the database are calculated by multivariate analysis. The target of compound is estimated from the similarity. In addition, significantly changed protein spots caused by the compound is applicable for the estimation of the pathway and the target of the compound. If necessary, quantitative proteomics by LC-MS / MS will be performed to analyze the details of the increase/decrease in protein expression or proteins related to the compound action will be identified.
However, in the case of no target in the HeLa cells or insufficient proteomic change, the estimation of the target will be difficult.
【方法】
Method
HeLa細胞を培養用シャーレ（6 cm径）にまき込み、翌日サンプルを添加、18時間培養後、回収した細胞を可溶化、2D-DIGEのシステムを用いて296スポットの定量を行う。同時に調製した化合物未処理のコントロールから得られた定量値に対する増減の比を計算し評価に用いる。化合物濃度はHeLa細胞を48時間処理したときにHeLa細胞の増殖を80%以上阻害する濃度で行う。
HeLa cells are plated in a culture dish (6 cm diameter) and the compound is added to the cells on the next day. After 18 h incubation, collected cells are solubilized with buffer and the expression of 296 spots are quantified by 2-D DIGE. The control lysate from HeLa cells treated with DMSO is prepared simultaneously. The fold ratio of each expression spot against that of the control is calculated and used for the evaluation.
【化合物の評価】
Evaluation of compounds
得られたスポットの増減値を、これまで測定したデータベース化した80化合物と比較するために、多変量解析を用いて類似度を計算し、サンプルの作用機作の推定、あるいは、新規性の評価を行うとともに、顕著に増減の認められたスポットを抽出し、特定のパスウェイに及ぼす作用を評価する。また、必要な場合には、LC―MS /MSによる定量プロテオミクスを用いてタンパク質の発現量の増減の詳細、あるいは、関連タンパク質の同定を行う。
In order to compare the increase/decrease of values with the 80 compounds in our database, multivariate analysis is used. The mechanism of action of the compound is estimated or the novelty of the compound is evaluated. Significantly changed spots among the 296 spots are extracted for the evaluation of the effect on specific pathways. If necessary, quantitative proteomics by LC-MS / MS will be performed to analyze the details of the increase/decrease in protein expression or proteins related to the compound action will be identified.
【欲しい情報】
Desired information (if available)
有効濃度や処理時間
Effective dose and time treated.
【参考文献】
References
- Muroi M, Futamura Y, Osada H. “Integrated profiling methods for identifying the targets of bioactive compounds: MorphoBase and ChemProteoBase.” Nat. Prod. Rep. 33:621-5 (2016). https://doi.org/10.1039/c5np00106d
- Muroi M, Kazami S, Noda K, Kondo H, Takayama H, Kawatani M, Usui T, Osada H. “Application of proteomic profiling based on 2D-DIGE for classification of compounds according to the mechanism of action.” Chem. Biol. 17:460-70 (2010). https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2010.03.016
- Muroi M, Osada H. ”Proteomic profiling for target identification of biologically active small molecules using 2D DIGE.” Methods Mol. Biol. 1888:127-39 (2019). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8891-4_7
- 室井 誠, 馬島 哲夫, 牛嶋 大, 松浦正明. オミックス解析：表現型・薬物活性とリンクする分子経路の探索, マウス・ラット モデル動物作製・解析プロフェッショナル”(先端モデル動物支援プラットフォーム(AdAMS) 編), pp 264-275, 羊土社, 2021.